Студенты ФБГиЗ на научной стажировке

С 27 ноября по 11 декабря на базе Лимнологического института СО РАН (г. Иркутск) прошла стажировка Павлова Егора, студента 3 курса направления «биология» (руководитель д.б.н. Кутырев И.А.).

Две недели пролетели незаметно, хотя работа кипела даже по выходным! Наша цель исходила из подбора наиболее информативных праймеров и оптимальных условий проведения полимеразно-цепной реакции (ПЦР) и ПЦР в реальном времени с целью создания системы молекулярных маркеров для идентификации генов теплового шока у лососевых рыб.

Для справки: В настоящее время в мире активно обсуждаются разные аспекты изменения климата в контексте глобального потепления. Температура является одной из факторов окружающей среды, влияющих на биохимическую и физиологическую функцию водных животных. Пресноводные виды часто подвергаются температурным воздействиям. В силу сезонных колебаний температуры поверхностных вод и в сочетании с повышением глобальных температур, рыбы оказываются в состояние долгосрочного хронического экологического стресса. Всесторонний обзор исследований секвенирования РНК, проведенных на нескольких видах рыб за последнее десятилетие, показывает, что хронический стресс нарушает регуляцию многих генов, поддерживающих гомеостаз. К счастью, большинство рыб имеют эндогенные механизмы, которые позволяют им справляться с изменениями температуры через синтез белков теплового шока.

Исходя из актуальности проблемы, мы провели серию экспериментов по воздействию летальных температур на байкальского представителя ихтиофауны озерного сига (Coregonuslavaretus L.). Эксперименты проводились на молоди сига в резервуарах с рециркулирующей водой на базе лаборатории ихтиологии Лимнологического института СО РАН. Рыбы были разделены на группы: при нормальных условиях; при условии тренировочного поднятия температуры на стадии икринок (рыбу «закаляли»), а затем при поднятии температуры до теплового шока; и нетренированных рыб после поднятия температуры до теплового шока. Рыбу держали при повышенных температурах, а затем переводили обратно к соответствующей температуре акклиматизации для восстановительного периода. Сразу после восстановительного периода рыбу усыпляли путем передозировки 0,01% трикаинаметансульфоната (MS-222). Далее мы отбирали жабры, почку, печень, сердце и белые мышцы, которые замораживались жидким азотом и хранились при −80°C. Общая РНК экстрагировалась из разных тканей сига с использованием реагента TRIzol® в соответствии с инструкциями производителя и набора фирмы «Амплитек» с использованием магнитных частиц. Концентрацию РНК определяли с помощью спектрофотометра NanoDrop 1000 (ThermoScientific). Отсутствие деградации РНК было подтверждено с помощью электрофореза агарозного геля. Затем мы синтезировали первую цепь кДНК, затем вторую из 1 мкг общей РНК с использованием наборов «Евроген» в ПЦР и ПЦР-RT. Использовали целый ряд праймеров для белков теплового шока (hsp90α, hsp90β, hsp70,hsc70, hsp47) и генов домашнего хозяина (β-actin, gapdh), в качестве контроля.

На словах работа звучит довольно просто, но в реальности подбор оптимальных условий для проведения такой работы это трудоёмкий и долгий процесс, который требует большой внимательности, концентрации и особой осторожности. Наша работа находится только на начальном этапе, очень много сложностей в связи с тем, что сиговые являются непростым генетическим объектом с тетраплоидным геномом. Поэтому впереди ждет очень много интересной, напряженной работы.
За время практики я познакомился соинтересными людьми, сотрудниками лаборатории, учёными. Огромное спасибо хочу сказать преподавателю и куратору моей практики к.б.н. Любови Васильевне Сухановой; за определение темы исследования д.б.н. Ивану Александровичу Кутыреву; за наставничество и помощь к.б.н. Ольге Евгеньевне Мазур, а так же руководству Лимнологического института и Бурятского Государственного университета за предоставленную возможность стажировки на современном оборудовании для решения актуальных научных проблем.